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上海快基生物科技有限公司

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EGFP慢病毒载体构建服务
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产品: 浏览次数:950EGFP慢病毒载体构建服务 
规格: kingenome
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最后更新: 2009-11-23 15:34
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详细信息
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中,是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的,这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时,它指导的转录就会停止,在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~21ntRNA和~50ntRNA茎环结构(stem loop)。在siRNA表达载体中,构成siRNA的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4~5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法,寻找高效的siRNA,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入siRNA表达载体。 这一系统的目的,主要是为了解决以下问题: ● 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且 目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 ● 进行稳转细胞株的筛选; ● 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液; 基本步骤: 1 根据目的基因相关信息(序列,序列号等),利用高效的设计软件,设计 siRNA序列,针对每条目的基因,我们设计3条siRNA序列,其中1条序列为阴性对照组; 2 根据设计好的 siRNA序列,设计,合成两条互补的短片段的DNA; 3 对合成好的 DNA片段进行稀释,退火,连接到线形化处理过的载体,转化,涂平板,过夜培养; 4 通过 PCR的方法筛选阳性菌落,进行测序,分析测序结果; 5 对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的不含内毒素的 siRNA病毒穿梭质粒; 6 利用构建好的质粒做转染实验,筛选出一条最有效的siRNA序列; 7 筛选出的高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T细胞,进行病毒包装和生产,收集病毒液; 8 浓缩、纯化病毒液,测定滴度; 9 提供高质量的病毒液给用户,通常状况下,筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 用户提供信息: ◆ 用户具体需要的服务项目 ◆ 所要表达的外源基因的名称,序列,如有现成的DNA模板可提供并提供电泳图片,图谱等相关信息 ◆ 是否需要检测外源基因的表达,如需要请提供相应的抗体 ◆ 所需要的病毒滴度 ◆ 如需要筛选稳定细胞株的用户需选择符合自己需要的细胞株 交付结果: ◆ 插入慢病毒载体中目的基因的测序报告 ◆ 提供构建好的慢病毒载体质粒,并附上酶切或PCR鉴定结果 ◆ 对于需要获得病毒的用户,我们将提供1ml 含106-107病毒的浓缩后病毒液,并附上一份QC报告 ◆ 对于需要通过慢病毒获得稳定细胞株的客户,我们将提供106数量的细胞,并附上一份QC报告
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